Metoda genetică moleculară de investigare

Pentru a studia și identifica variante în structura ADN, se folosește metoda genetică moleculară. Pentru fiecare regiune ADN care este examinată, regiunea este un cromozom, o genă sau o alelă, metodele sunt diferite. În inima fiecărei metode moleculare genetice există o anumită manipulare a ARN-ului și a ADN-ului. Toate aceste metode sunt extrem de complexe, fără ca condițiile de laborator să nu poată fi efectuate, iar personalul trebuie să aibă o înaltă calificare. Această activitate se desfășoară în mai multe etape.

etape

Mai întâi, trebuie obținute probe de ARN sau ADN. Aici, o metoda genetica moleculara poate fi aplicat la orice material virtual: o picătură de sânge, leucocite, fibroblastele de cultură, mucoasa (fragmentat), chiar foliculilor de par, - ADN-ul poate fi obținut din orice probă. Este potrivit pentru aplicarea oricărei metode moleculare genetice și a diferitelor variante ale acestora, iar ADN-ul deja alocat este stocat pentru o perioadă lungă de timp în timpul înghețării. A doua etapă este dedicată acumulării fragmentelor dorite (amplificare) a ADN-ului, deoarece aceasta ajută la asigurarea reacției în lanț a polimerazei in vitro (in vitro, fără implicarea organismului viu). Ca rezultat, fragmentul ADN selectat se multiplică cu această reacție în lanț, iar cantitatea de ADN crește literalmente de un milion de ori.

A treia etapă a metodelor moleculare genetice de investigare este restricționarea ADN-ului multiplicat (aceasta este fragmentarea, ruperea sau tăierea). Restricția se realizează prin electroforeză pe bază de poliacrilamidă sau gel de agaroză. Această metodă moleculară genetică de studiu a ADN permite fiecărui fragment să ocupe o anumită poziție în gel. După aceea, gelul este tratat cu bromură de etidiu, care este capabil să se lege în ADN, se efectuează iradierea ultravioletă, după care se pot observa regiunile luminescenței. Metodele genetice genetice de diagnosticare sunt diverse și numeroase, totuși, primele două etape sunt tipice pentru toți. Dar pentru a identifica fragmente de ADN, gelul poate fi colorat cu multe alte metode existente.

specie

Metodele cele mai directe și mai răspândite pentru detectarea micobacteriilor includ metoda genetică moleculară descrisă mai sus pentru studierea ADN-ului. Esența sa constă în dezvăluirea în fragmentele specifice de material de diagnostic ale lanțului agenților patogeni ADN. Metodele genetice genetice de diagnosticare nu au încă o modalitate mai eficientă de a recunoaște o astfel de boală ca tuberculoza. Folosind reacția în lanț a polimerazei (PCR), puteți fi sigur că ADN-ul original, va crește numărul de copii într-un milion de ori, adică, vor exista amplificare, și va afișa rezultatele. Nivelul de sensibilitate aici este foarte ridicat - mai mult de 95%, ceea ce reprezintă principalul avantaj al acestei metode.

Restul metodelor moleculare genetice de cercetare asupra eficienței randamentului copii multiple literalmente dublat, deoarece, în acest caz, eșantionul de redactare prezintă o secvență de oligonucleotide specifică crescută la o sută de șase ori. Chiar și diagnosticul cultural al tuberculozei organelor respiratorii este mult mai scăzut în sensibilitatea sa. De aceea, medicina modernă se bazează pe metode genetice moleculare pentru diagnosticarea tuberculozei. Și metoda descrisă este deosebit de eficientă la o întâlnire cu agenți patogeni de variabilitate antigenică ridicată, pentru a determina care într-un alt mod este mult mai dificil - special medii nutritive și un timp îndelungat de cultivare. Metodele biochimice și moleculare genetice dau efecte complet diferite.

Diagnosticul tuberculozei

Ei construiesc diagnosticarea PCR a tuberculozei cel mai adesea folosind acele secvențe de ADN care sunt specifice pentru toate cele patru tipuri ale acestei boli. Pentru atingerea acestui scop folosesc adesea primeri care detectează secvența IS elemente (IS-986, IS-6110), deoarece aceste elemente caracterizează specii mari migratoare Mycobacterium tuberculosis și întotdeauna prezente mai multe copii in genomul. De asemenea, ADN-ul poate fi izolat din culturi pure și clinice (sputa de pacienți) prin orice altă metodă acceptabilă. De exemplu, există metoda Boom, care folosește un tampon de liză pe bază de guanidină, silice și tiocianat ca purtător al ADN-ului. Numărul de pacienți care diferă bacteriologică săracă în creștere în fiecare an, și, prin urmare, în practica clinică a stabilit un nivel complet diferit de organizare: metoda moleculara genetica de a studia ADN-ul a jucat un rol major in diagnosticul.

Cu toate acestea, trebuie să recunoaștem că nu este fără defecte. Utilizarea metodei PCR aduce adesea o mare cantitate de rezultate fals pozitive, iar vina aici nu este numai erori tehnice, ci și particularitățile metodei în sine. Printre altele, folosirea acestei metode de diagnostic pentru a determina gradul de viabilitate al micobacteriilor identificate, este pur și simplu imposibil. Dar acest neajuns nu este cel mai important. Metodele genetice genetice ale diagnosticului PCR implică pericolul contaminării ADN-ului micobacterian. Cerințele de certificare din acest motiv pentru laboratoarele PCR sunt extrem de rigide, necesită prezența a trei camere izolate. Tehnologia PCR este modernă și foarte complexă, utilizarea acesteia necesită echipamente adecvate și un personal bine instruit.

bacterioscopia

În cazul în care rezultatele analizei diagnostic trebuie să fie comparate cu alte date: examen clinic, radiografie, examen microscopic, cultură și chiar ca răspuns la un tratament specific sunt foarte importante. În această serie de studii, PCR este doar una dintre componente. Detectarea agentului patogen la începutul diagnosticului poate fi metoda cea mai simplă și rapidă - bacteriologică.

Aici folosim un microscop luminos (culoarea Tsiol-Nielsen) și o luminescentă (colorare cu fluorochrom). Avantajul bacterioscopiei este viteza cu care se obțin rezultatele. Un dezavantaj al acesteia este considerat a fi posibilitățile limitate datorită sensibilității scăzute. Cu toate acestea, această metodă este recomandată de OMS ca fiind cea mai economică și de bază pentru identificarea pacienților cu tuberculoză. Detectarea micobacteriilor printr-o metodă bacteriologică are valoarea unui prognostic și se cuantifică eliberarea bacteriană. Metodele genetice genetice de studiere a tuberculozei sunt mult mai încrezătoare în acest lucru.

Cercetare culturală

Cea mai bună detectare a micobacteriilor este recunoscută de studiile de cultură. Semănarea materialului patologic se efectuează în mediile de ouă: Mordovsky, Finn II, Levenshtein-Jensen și altele asemenea. Standarde de rezistență micobacteriilor la medicamente și dovezi indirecte ale eficacității unui număr de micobacterii și coloniile lor in vitro, dacă metoda aplicată culturii cercetării. Pentru a crește procentul de alocare a micobacteriilor, materialul patologic este semănat în mai multe medii.

Satisfacând numeroasele nevoi culturale, agentul cauzator este de asemenea prevăzut cu medii lichide. În același timp, sunt utilizate sisteme automate de contabilitate pentru creșterea tipului VANTES. Culturile ar trebui incubate până la șapte până la opt săptămâni. În acest moment, semănarea cu o lipsă de creștere poate fi considerată negativă. Cea mai eficientă modalitate de a identifica tuberculoza micobacteriilor este teste biologice: infectează materialul de diagnosticare al cobailor, care sunt extrem de sensibili la tuberculoză.

Cateva cifre

Cel mai interesant domeniu de cercetare, care a fost descoperit prin diagnosticarea PCR, a fost studiul M. tuberculosis, o infecție latentă. Conceptul modern de infecție cu tuberculoză sugerează că din o sută de persoane care au fost în contact cu M. tuberculosis, nouăzeci pot fi infectate, dar numai 10 dintre ele au o boală activă. Restul au imunitate antituberculoasă și, prin urmare, în nouăzeci la sută din cazuri infecția va rămâne latentă. A fost metoda genetică moleculară care a ajutat la detectarea acestui tipar.

Geneticienii spun că cincizeci și cinci la sută din cei ale căror culturi patologice materiale au fost negative, optzeci la suta din persoanele infectate cu M. tuberculosis, dar care curge fără manifestări radiologice ale bolii, PCR a primit răspunsuri pozitive. Este o metodă de diagnostic genetic a ajutat la identificarea pacienților cu risc de studii PCR, cu rezultatele analizelor lor (microscopie și cultură) au fost negative, iar infecția subclinică M. tuberculosis a fost prezent.

Cercetări moderne

Laboratoarele bacteriologice din Federația Rusă utilizează o metodă accelerată a concentrațiilor absolute: activitatea de reductază a nitraților din micobacterii este testată cu ajutorul reactivului Griss. Centrele anti-tuberculoză utilizează o metodă care permite determinarea rezistenței la medicament. Aceasta este o cultură în medii lichide, unde este automatizat un sistem radiometric și fluorescent pentru înregistrarea creșterii micobacteriilor. O astfel de analiză se face rapid - până la două săptămâni.

În prezent, se dezvoltă noi metode: rezistența la medicament a micobacteriilor este estimată la nivelul genotipului. Studiul mecanismelor moleculare de rezistență arată prezența genelor în micobacterii. Aceste gene sunt asociate cu rezistența la anumite medicamente. De exemplu, genele Kasa, INHA, katG rezistente la izoniazidă, gena rpoB - gene rifampicina ARN 16Sp și rpsL - streptomicină, emb1 - ethambutol, girA - un fluorochinolonelor și așa mai departe.

mutații

În diagnosticul modern, nivelul molecular genetic al metodei ADN a crescut semnificativ și a permis efectuarea de studii pe scară largă a mutațiilor în întregul lor spectru. Acum știm că mutațiile din codurile 516, 526 și 531 ale genei rpoB sunt cele mai frecvente și sa identificat rezistența la diferite medicamente. Există o întreagă gamă de metode de tipare a micobacteriilor, folosind nu numai metode tradiționale - biochimice, biologice și culturale, ci și metode genetice moderne moderne. Deja există metode adecvate și fiabile de diagnosticare pentru detectarea bolilor monogene. Ele se bazează pe cercetarea ADN în regiunea exactă a unei anumite gene. Acesta este de obicei un proces complex, consumator de timp și costisitor, dar datele furnizate de metodele de analiză moleculară genetică sunt mult mai precise și mai informative decât datele tuturor celorlalte analize.

Acesta a fost mult timp cunoscut faptul că ADN-ul nu se schimba pentru întreaga viață a organismului, care este, în orice odnakova celulele nucleate, iar acest lucru face posibil să se ia analiza absolut toate celulele corpului, în orice stadiu al ontogenie. Gena deteriorat poate fi detectată înainte de apariția primelor simptome la scară largă bolii clinice, precum si la persoanele heterozigote sănătoși, dar care au o mutatie in gena. metodele de diagnostic genetic boli ereditare moleculara permite sa dezvaluie sale (abordare directă, ADN-diagnosticare), precum și pentru a analiza segregarea bolii în familie cu ADN marker de loci (polimorfisme genetice), care sunt strâns legate de o genă deteriorată (de exemplu, abordarea indirectă a ADN-diagnosticare). În mod direct sau indirect - orice diagnostic ADN-ului se bazează pe metodele de identificare a unei porțiuni strict definită a ADN-ului uman.

Metode directe

Metodele directe de diagnosticare a ADN-ului sunt folosite în cazurile în care se cunoaște genul-vinovat al bolii ereditare, iar tipurile de mutații ale sale sunt, de asemenea, cunoscute. De exemplu, metodele directe sunt adecvate pentru o varietate de boli. Asta este Horea lui Huntington (expansiunea repetițiilor CTG), fenilcetonuria (R408W), fibroza chistică (delF508, mutație majoră) și altele asemenea. Principalul avantaj al metodei directe este o precizie de 100% a diagnosticului și nu este necesară analiza ADN a restului familiei. Dacă se găsește o mutație în gena corespunzătoare, aceasta vă permite să confirmați corect diagnosticul de ereditate, să determinați genotipul pentru restul familiei împovărate.

Un alt avantaj al diagnosticului direct este detectarea transportului heterozygos al mutațiilor rele în rudele și părinții decedatului de la boală. Acest lucru este valabil mai ales pentru bolile recesive autosomale. De asemenea, sunt disponibile dezavantaje ale metodelor directe. Pentru a le aplica, trebuie să știți exact localizarea genei patologice, structura exon-intron și spectrul mutațiilor sale. Nu toate bolile monogene au primit astfel de informații astăzi. Informativitatea metodelor directe nu poate fi considerată completă, deoarece aceeași genă poate avea un număr mare de mutații patologice, care determină dezvoltarea bolilor ereditare.

Metode indirecte

Metodele indirecte în diagnosticarea ADN sunt folosite la toate, în alte cazuri, în cazul în care gena deteriorat nu este identificat, dar numai cromozomial, sau în cazul în care diagnosticul linie nu a dat rezultatul (se întâmplă, în cazul în care gena organizației complexe moleculare sau într-o mare măsură, în cazul în care există o mulțime mutații patologice). Metodele indirecte efectuat analiza segregare a markerilor polimorfici în familia alelice. Markeri găsite în aceeași regiune cromozomială sau locusul este strâns legată de boală și reprezintă deleții sau inserții, substituții punctiforme, se repetă, iar polimorfismul acestora se datorează diferite cantități de celule din bloc.

Cel mai convenabil pentru diagnostic considerate microsatelit și minisatellite polimorfisme indirecte, care sunt distribuite pe scară largă în genomul uman. Valoarea lor este exprimată în informativitate ridicată, dacă distanța genetică dintre daunele din gena și marker nu este prea mare. In acest ultim caz, precizia de estimare este determinată în mare măsură de frecvența recombinării între marker polimorfic și daune. Metodele de diagnosticare indirectă furnizează, de asemenea, etapa preliminară obligatorie a frecvențelor alelelor ale studiului populației analizate în rândul pacienților și purtători de mutații, plus necesitatea determinării probabilității de recombinare a markerilor neechilibru și adeziune și alele mutante.

Alte metode

segmente scurte de ARN-ului sau ADN-ului, precum și gena unic vizualizate în studiu microscopic nu poate fi, prin urmare, pentru a identifica mutațiile necesare diagnosticului genetic molecular. Există un „Proiectul genomului uman“, precum și alte progrese in genetica moleculara extins foarte mult posibilitatea de diagnosticul bolilor ereditare - pre- și post-natale. Aceste metode pot oferi depistarea precoce și de a face o poli- predictie si boli monogenice, a carui debut are loc la vârsta adultă. Din păcate, din cauza capacităților tehnice ale studiilor genetice moleculare sunt, uneori, dincolo de limitele etice care sunt stabilite în ceea ce privește moștenirea, mai ales atunci când diagnosticul este in adolescenta si copilarie.

Anomaliile structurale și cantitative ale cromozomilor sunt cele mai frecvente cauze ale bolilor oncologice și ale numeroaselor anomalii de dezvoltare. cromozomale trebuie să fie identificate, ceea ce este important pentru consiliere de familie - pentru a evalua prognoza, impreuna cu un risc de reproducere la sarcinile viitoare. Analiza cromozomilor este "standardul de aur" al diagnosticului genetic, dar are și posibilități limitate. Numai metode analiza moleculară genetică Ei pot face mai mult, pentru că există clonarea tehnologiei bazate pe etichete fluorescente capabile de sensibilitatea lor de mare pentru a identifica modificari cromozomiale subtile care sunt imposibil de a găsi un clasic cercetarea citogenetică. Aceste tehnici se extind din ce în ce capacitățile noastre de diagnostic, atunci când a examinat, copiii cu dizabilități de dezvoltare, retard mintal, cu multe alte boli ereditare.

constatări

Este foarte important pentru omenire au structura genei și funcția de cunoaștere, tipuri de variabilitate, capacitatea de a detecta boli ereditare care au avut loc în legătură cu dezvoltarea geneticii moleculare. Metodele sale au ca scop studiul moleculei de ADN - și atunci este normal, iar când acesta este deteriorat. Prepararea secvențelor de acid dezoxiribonucleic de nucleotide (ADN) se extinde în etape de la primirea mostrelor pentru a identifica fragmente individuale. Izolarea ADN-ului genomic din celulele, restrictie (lacrimare), amplificare (clonare), electroforeza a fragmentelor (care separă sarcina lor electrică și greutatea moleculară de gel de agaroză). Identificarea anumitor fragmente situate pe suprafața sa printr-o bandă discretă.

Apoi intra in filtre speciale, actul prin care trece fiecare fragment de hibridizare cu fragmente ADN donate sau sonde radioactive sintetice este un control, care va fi egală cu fiecare probă. Dacă schimbați poziția sau lungimea în comparație cu proba, în cazul în care un nou fragment sau dispărut - toate acestea sugerează că gena analizată a suferit restructurare în secvența de nucleotide. Există opt tehnici de bază de studii genetice moleculare: secvențiere (determinarea secvenței ADN), reacția în lanț a polimerazei (creșterea numărului de secvențe), prepararea grunduri cunoscute gene, clonarea ADN, producerea de molecule recombinante proteine ​​derivate datorate moleculelor recombinante, creând un set complet (colecție bibliotecă) fragmente care au fost obținute prin utilizarea de restricție clonate.