Metode biologice de cercetare și utilizare a acestora

Biologie Moleculara metode de cercetare

Metode biologice de investigare biologice. Ce este?

În anii `70 și `80, oamenii de știință au fost capabili să descifreze genomul uman pentru prima dată. Acest eveniment a dat un impuls dezvoltării ingineriei genetice și biologiei moleculare. Studiul proprietăților ADN și ARN a dus la faptul că acum este posibil să se utilizeze acești acizi nucleici pentru a diagnostica boala, a studia genele.

Prepararea ADN și ARN

Biologie Moleculara metodele de diagnosticare necesită prezența materiei prime: mai des este acizii nucleici. Există mai multe modalități de a izola aceste substanțe de celulele organismelor vii. Fiecare dintre ele are avantajele și dezavantajele sale și acest lucru trebuie luat în considerare la alegerea metodei de izolare a acizilor nucleici în formă pură.

1. Pregătirea ADN în conformitate cu Marmur. Metoda constă în tratarea amestecului de substanțe cu alcool, ca rezultat al precipitării ADN pur. Dezavantajul acestei metode este utilizarea substanțelor agresive: fenol și cloroform.

2. Izolarea ADN-ului de către Boom. Substanța de bază utilizată aici este tiocianatul de guanidină (GuSCN). Promovează precipitațiile deoxiribonucleic pe substraturi specializate, din care în viitor poate fi colectat folosind un tampon special. Cu toate acestea GuSCN - este un inhibitor al TCP, și chiar și o mică porțiune din care se depune in ADN-ul poate influența cursul reacției în lanț a polimerazei, care este important atunci când se lucrează cu acizi nucleici.

3. Precipitarea impurităților. Metoda diferă de cea anterioară prin faptul că moleculele de acid deoxiribonucleic în sine nu sunt precipitate, ci impurități. Pentru a face acest lucru, utilizați schimbătoare de ioni. Dezavantajul este că nu toate substanțele pot precipita.

4. Screening-ul de masă. Această metodă este utilizată în acele cazuri în care nu sunt necesare informații precise privind compoziția moleculei de ADN, dar este necesar să se obțină date statistice. Acest lucru se datorează faptului că structura acidului nucleic poate fi deteriorată prin tratarea cu detergenți, în special cu alcalii.

Clasificarea metodelor de cercetare

Toate metodele biologice de cercetare biologică sunt împărțite în trei grupe mari:

1. Amplificare (folosind o varietate de enzime). Aceasta include reacția în lanț PCR-polimerază, care joacă un rol important în multe dintre metodele de diagnosticare.

2. Non-appellation. Acest grup de metode este direct legat de funcționarea amestecurilor de acizi nucleici. Exemple sunt 3 tipuri de blotting, hibridizare in situ, etc.

3. Metode bazate pe recunoașterea unui semnal dintr-o moleculă de sondă care se leagă la o probă specifică de ADN sau ARN. Un exemplu este un sistem de hibridizare într-o soluție de sistem de captare hibridă (hc2).

Enzimele care pot fi utilizate în metodele biologice moleculare

Multe metode de diagnostic molecular implică utilizarea unei game largi de enzime. Mai jos sunt cele mai frecvent utilizate:

1. Restrictase - "taie" molecula ADN în părțile necesare.

2. ADN polimeraza - sintetizează o moleculă dublu catenară de acid deoxiribonucleic.

3. Reverse transcriptază (reversă) - folosită pentru a sintetiza ADN-ul pe matricea ARN.

4. Ligaza ADN - responsabilă de formarea legăturilor fosfodiesterite între nucleotide.

5. Exonucleaza - îndepărtează nucleotidele din secțiunile finale ale moleculei de acid deoxiribonucleic.

PCR este principala modalitate de amplificare a ADN-ului

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este folosit în mod activ în biologia moleculară modernă. Aceasta este o metodă în care un număr mare de copii pot fi obținute de la o singură moleculă de ADN (amplifică molecule).

Principalele funcții ale PCR sunt:

- diagnosticarea bolilor;

- clonarea ADN-ului, a genelor.

Pentru a realiza reacția de polimerizare în lanț necesită următoarele elemente: molecula de ADN initial, o ADN polimerază termostabilă (Taq sau Pfu), fosfați deoxiribonucleotide (surse de baze de azot), primerii (primer 2 moleculă 1 ADN) în sine sistemul tampon, în care toate reacțiile sunt posibile.

PCR constă din trei etape: denaturarea, recoacerea primerilor și alungirea.

1. Denaturarea. La o temperatură de 94-95 grade Celsius, ruperea legăturilor de hidrogen între cele două fire ADN continuă și, ca rezultat, obținem două molecule cu un singur lanț.

2. Reacția primerilor. La o temperatură de 50-60 de grade Celsius se produce grunduri de aderare la capetele moleculelor de acid nucleic mono-catenare în funcție de tipul de complementaritate.

3. Alungirea. La o temperatură de 72 de grade, se produce sinteza moleculelor duble de catenă dublă de acid deoxiribonucleic.

Secvențierea ADN-ului

Metodele biologice biologice necesită adesea cunoașterea secvenței de nucleotide din molecula de acid deoxiribonucleic. Pentru a determina codul genetic secvențierea este efectuată. Diagnosticarea moleculară a viitorului se va baza pe cunoștințele obținute în determinarea succesiunii unei persoane.

Se disting următoarele tipuri de secvențiere:

• secvențierea lui Maxam-Gilbert;
• secvențierea lui Sanger;
• pirosecvențare;
• secvențierea nanoporoasă.