Enzime imobilizate și utilizarea lor

Pentru prima dată conceptul de enzime imobilizate a apărut în a doua jumătate a secolului al XX-lea. Între timp, încă din 1916, s-a constatat că sucroza sorbată pe cărbune își păstrează activitatea catalitică. In 1953, D. și N. Shleyt Grubhofer efectuat pepsinei primei legare, amilaza, carboxipeptidaza și RNazei la un purtător insolubil. Conceptul de enzime imobilizate a fost legalizat în 1971. Aceasta sa întâmplat la prima conferință privind enzimologia ingineriei. În prezent conceptul de enzime imobilizate

Informații generale

șisubstanțe imobilizate - compușii care sunt legați în mod artificial la un purtător insolubil. În același timp, își păstrează proprietățile catalitice. În prezent, acest proces este luat în considerare în două aspecte - în cadrul limitării parțiale și complete a libertății de mișcare a moleculelor de proteine.

demnitate

Oamenii de stiinta au stabilit anumite avantajele enzimelor imobilizate. Acționând ca catalizatori heterogeni, ei se pot separa cu ușurință de mediul de reacție. Ca parte a cercetării, sa stabilit că aplicarea enzimelor imobilizate pot fi multiple. În timpul procesului de legare, compușii își schimbă proprietățile. Ei dobândesc specificitatea substratului, stabilitatea. În același timp, activitatea lor începe să depindă de condițiile de mediu. Enzime imobilizate se disting prin durabilitatea si gradul ridicat de stabilitate. Este mai mult decât, de exemplu, enzimele libere în mii, zeci de mii de ori. Toate acestea asigură o eficiență ridicată, competitivitatea și economia tehnologiilor în care sunt prezente enzimele imobilizate.

purtătorii

J. Poratu a definit proprietățile cheie ale materialelor ideale care ar trebui utilizate pentru imobilizare. Mass-media trebuie să aibă:

1. Insolubilitate.
2. Rezistență ridicată la nivel biologic și chimic.
3. Abilitatea de a activa rapid. Transportatorii ar trebui să se transforme cu ușurință într-o specie reactivă.
4. Hidrofilicitate semnificativă.
5. Permeabilitatea necesară. Indicele său ar trebui să fie la fel de acceptabil pentru enzime și pentru coenzime, produse de reacție și substraturi.

În prezent, nu există niciun material care să îndeplinească pe deplin aceste cerințe. Cu toate acestea, în practică, sunt utilizați purtători care sunt adecvați pentru imobilizarea unei anumite categorii de enzime în condiții specifice.

clasificare

În funcție de natura lor, materialele în legătură cu care sunt transformate compușii substanțe imobilizate, sunt împărțite în anorganice și organice. Legarea multor compuși se efectuează cu purtători polimerici. Aceste materiale organice sunt împărțite în două clase: sintetice și naturale. În fiecare dintre ele, la rândul lor, grupurile se disting în funcție de structură. Terminalele anorganice sunt compuse în principal din sticlă, ceramică, lut, silicagel, negru de grafit. Când se lucrează cu materiale, metodele de chimie uscată sunt populare. Enzimele imobilizate sunt obținute prin acoperirea purtătorilor cu un film oxizi de titan, aluminiu, zirconiu, hafniu sau prelucrare cu polimeri organici. Un avantaj important al materialelor este ușurarea regenerării.

Purtători de proteine

Cele mai populare sunt lipidele, polizaharidele și materialele proteice. Dintre acestea din urmă merită să se evidențieze polimerii structurali. Acestea includ în primul rând colagen, fibrină, keratină, precum și gelatină. Asemenea proteine ​​sunt distribuite pe scară largă în mediul natural. Sunt accesibile și economice. În plus, au un număr mare de grupuri funcționale pentru legare. Proteinele diferă în ceea ce privește capacitatea lor de biodegradare. Acest lucru face posibilă extinderea aplicației enzime imobilizate în medicină. Între timp, există și proprietăți negative ale proteinelor. Dezavantaje ale utilizării enzimelor imobilizate pe purtătorii de proteine ​​sunt imunogenitatea ridicată a acestora din urmă, precum și posibilitatea introducerii în reacție numai a unor grupuri de aceștia.

Polizaharide, aminozaharide

Din aceste materiale, chitina, dextranul, celuloza, agaroza și derivații lor sunt cel mai adesea utilizați. Pentru ca polizaharidele să fie mai rezistente la reacții, lanțurile lor liniare sunt reticulate cu epiclorhidrină. Diferite grupuri ionogene sunt introduse liber în structurile de plasă. Chitina este acumulată în cantități mari sub formă de deșeuri în timpul procesării industriale a creveților și a crabirilor. Această substanță este rezistentă la substanțe chimice și are o structură poroasă bine definită.

Polimeri sintetici

Acest grup de materiale este foarte divers și accesibil. Acesta include polimeri pe bază de acid acrilic, stiren, alcool polivinilic, poliuretan și polimeri de poliamidă. Majoritatea dintre ele diferă în ceea ce privește rezistența mecanică. În procesul de transformare, acestea oferă posibilitatea de a varia dimensiunea porilor într-un domeniu suficient de larg, introducerea unei varietăți de grupuri funcționale.

Modalități de legare

În prezent, există două versiuni fundamentale diferite ale imobilizării. Prima este prepararea compușilor fără legături covalente cu purtătorul. Această metodă este fizică. O altă opțiune implică formarea unei legături covalente cu materialul. Aceasta este o metodă chimică.

adsorbție

Cu ea substanțe imobilizate se obțin prin menținerea preparatului pe suprafața purtătorului datorită dispersiei, interacțiunilor hidrofobe, electrostatice și legăturilor de hidrogen. Adsorbția a fost primul mod de a limita mobilitatea elementelor. Cu toate acestea, chiar și acum această opțiune nu și-a pierdut relevanța. În plus, adsorbția este considerată cea mai obișnuită metodă de imobilizare în industrie.

Caracteristicile metodei

În publicațiile științifice sunt descrise mai mult de 70 de enzime, obținute prin metoda adsorbției. Ca purtători efectuate în mod avantajos, sticlă poroasă, diferite argile, polizaharide, alumină, polimeri sintetici, titan și alte metale. Acestea din urmă sunt cele mai des folosite. Eficacitatea adsorbției medicamentului pe purtător este determinată de porozitatea materialului și a suprafeței specifice.

Mecanism de acțiune

Adsorbția enzimelor pe materiale insolubile este simplă. Aceasta se obține prin contactarea soluției apoase a medicamentului cu purtătorul. Poate avea loc într-un mod static sau dinamic. Soluția de enzimă este amestecată cu un precipitat proaspăt, de exemplu, hidroxid de titan. Apoi, în condiții ușoare, compusul este uscat. Activitatea enzimatică cu această imobilizare este aproape 100%. În același timp, concentrația specifică ajunge la 64 mg pe gram purtător.

Momente negative

Dezavantajele adsorbției includ rezistența redusă atunci când se leagă enzima și purtătorul. În procesul de schimbare a condițiilor de reacție, se poate observa pierderea elementelor, contaminarea produselor, desorbția proteinei. Pentru a spori rezistența de legare, purtătorii sunt modificați anterior. În particular, materialele sunt tratate cu ioni metalici, polimeri, compuși hidrofobi și alți agenți polifuncționali. În unele cazuri, modificarea este supusă medicamentului în sine. Dar de multe ori acest lucru duce la o descreștere a activității sale.

Includerea în gel

Această opțiune este destul de comună datorită unicității și simplității acesteia. Această metodă este adecvată nu numai pentru elemente individuale, ci și pentru complexe multienzimice. Includerea în gel poate fi efectuată în două moduri. În primul caz, preparatul este combinat cu o soluție apoasă de monomer, urmată de polimerizare. Ca rezultat, apare o structură spațială a gelului, care conține moleculele enzimei din celule. În cel de-al doilea caz, preparatul se adaugă la soluția de polimer finit. Apoi se transferă în starea de gel.

Embedding în structuri semi-transparente

Esența acestei metode de imobilizare este separarea soluției apoase de enzime de substrat. Pentru aceasta, se folosește o membrană semipermeabilă. Ea trece elemente cu molecule scăzute de cofactori și substraturi și întârzie molecule mari de enzime.

microencapsulare

Există mai multe opțiuni pentru introducerea în structuri semi-transparente. Interesul cel mai important îl reprezintă microîncapsularea și încorporarea proteinelor în lipozomi. Prima variantă a fost propusă în 1964 de T. Chang. Aceasta constă în faptul că soluția enzimatică este introdusă într-o capsulă închisă, pereții căruia sunt realizați dintr-un polimer semipermeabil. Apariția membranei pe suprafață se datorează reacției de policondensare interfacială a compușilor. Unul dintre ele este dizolvat în organic, iar celălalt - în faza apelor. Ca exemplu poate fi menționată formarea unui microcapsule obținută prin policondensarea halogenuri acide sebacic la tine (faza organică) și 1,6-hexametilendiamină (respectiv, faza apoasă). Grosimea membranei este calculată în sute de micrometri. În acest caz, dimensiunea capsulelor este de sute sau zeci de micrometri.

Includerea în lipozomi

Această metodă de imobilizare este aproape de microîncapsulare. Lipozomii sunt reprezentați în sisteme lamelare sau sferice de bistraturi lipidice. Această metodă a fost folosită pentru prima dată în 1970. Evaporarea unui solvent organic este efectuată pentru a izola lipozomii din soluția lipidică. Filmul subțire rămas este dispersat într-o soluție apoasă în care este prezentă enzima. În timpul acestui proces are loc auto-asamblarea structurilor lipidice bilaterale. Sunt destul de populare enzime imobilizate în medicină. Acest lucru se datorează faptului că majoritatea moleculelor sunt localizate în matricea lipidică a membranelor biologice. Inclus în lipozomi enzime imobilizate în medicină sunt cele mai importante materiale de cercetare, permițând studierea și descrierea legilor proceselor de viață.

Formarea de noi linkuri

Imobilizarea prin formarea de noi lanțuri covalente și între enzimele native este considerat de cele mai multe biocatalizatori producție de masă pentru uz industrial. Spre deosebire de metodele fizice, această opțiune oferă o legătură ireversibilă și puternică între moleculă și material. Educația ei este adesea însoțită de stabilizarea drogului. Cu toate acestea, localizarea enzimei la bonding 1 minute covalente în raport cu purtătorul creează anumite dificultăți în efectuarea procesului catalitic. Molecula este separată de material printr-o inserție. Agenții poli- și bifuncționali acționează deseori ca și ei. Acestea, în special, sunt hidrazină, bromură de cianogen, dialgedrid glutaraldehidă, clorură de sulfuril și așa mai departe. De exemplu, pentru obținerea de enzime galactoziltransferază din mass-media și secvența inserată următoarea -CH₂-NH- (CH₂)₅-CO-. Într-o astfel de situație, există o inserție, o moleculă și un purtător în structură. Toți sunt legați prin legături covalente. O importanță fundamentală este necesitatea introducerii în reacție a grupărilor funcționale care nu sunt esențiale pentru funcția catalitică a elementului. De regulă, glicoproteinele sunt atașate la purtător nu prin proteine, ci prin partea de carbohidrați. Ca rezultat, mai stabil și mai activ substanțe imobilizate.

celulele

Metodele descrise mai sus sunt considerate universale pentru toate tipurile de biocatalizatori. Printre acestea, printre altele, se numără celule, structuri subcelulare, imobilizarea cărora a devenit recent răspândită. Acest lucru se datorează următoarelor. Când se imobilizează celulele, nu este necesară izolarea și purificarea preparatelor enzimatice, pentru a introduce cofactori în reacție. Ca rezultat, devine posibil să se obțină sisteme care realizează procese continue în mai multe etape.

Utilizarea enzimelor imobilizate

În medicina veterinară, industria, alte sectoare economice sunt preparate destul de populare obținute prin metodele de mai sus. Abordările dezvoltate în practică oferă soluția problemelor în implementarea livrării de droguri vizate în organism. Enzimele imobilizate au făcut posibilă obținerea medicamentelor cu durată lungă de acțiune cu minimă alergenitate și toxicitate. În prezent, oamenii de știință rezolvă problemele asociate cu bioconversia maselor și a energiei folosind abordări microbiologice. Între timp, tehnologia enzimelor imobilizate, de asemenea, aduce o contribuție semnificativă la această activitate. Perspectivele dezvoltării sunt destul de largi pentru oamenii de știință. Așadar, în viitor, unul dintre rolurile cheie în procesul de control al stării mediului ar trebui să aparțină unor noi tipuri de analize. În special, vorbim despre bioluminescente și metode imunoenzimatice. O importanță deosebită sunt abordările avansate în prelucrarea materiilor prime lignocelulozice. Este posibil să se utilizeze enzime imobilizate ca amplificatoare de semnale slabe. Site activ poate fi sub influența mass-media, care este sub sonicare, stres mecanic sau expuse la fitochimicale transformări.