Diagnosticul molecular: PCR în timp real

În prezent, a fost dezvoltat un mecanism în diagnosticarea moleculară reacția în lanț a polimerazei (PCR), care a fost impulsul pentru dezvoltarea unui număr mare metode de diagnostic boli bazate pe definiția materialului genetic. Pentru a efectua PCR în timp real, un fragment de gene (în special acid nucleic) agentul cauzator al bolii, care nu apare la alte persoane.

Principiul PCR este multiplicarea unei anumite milioane fragment ADN patogen de ori prin ADN polimerază într-o unitate specială, denumită termociclor, care asigură repetarea ciclică a regimului de temperatură pentru un anumit program.

Diagnosticarea PCR face posibilă repetarea unei serii de amplificări, păstrând activitatea enzimei. Când amplificarea trece neîngrădită, într-un singur ciclu numărul de copii ale unei anumite regiuni a ADN-ului patogen se dublează, după treizeci de cicluri - o sută și zece ori. Acesta este motivul pentru care PCR este folosit în diagnostic pentru a identifica agenți patogeni suficient de mici, a căror detectare este imposibilă fără aceasta.

Trebuie remarcat faptul că ARN nu poate fi o matrice pentru PCR în timp real. Prin urmare, pentru a detecta ARN viral, este necesar să se obțină ADN, corespunzător fragmentului său, înainte de amplificare. Reacția în lanț a polimerazei face posibilă măsurarea ADN și ARN ale agentului patogen. Informațiile obținute în acest mod sunt utilizate pentru a monitoriza eficacitatea terapiei utilizate, precum și pentru a evalua prognosticul clinic.

În plus, PCR în timp real nu necesită acțiuni suplimentare cu privire la decriptarea ADN țintă sau ampliconilor, care servesc ca o barieră în diagnosticul corect și să conducă la rezultate false. Această abordare ne permite să nu folosim stadiul de electroforeză, ceea ce duce la o reducere a riscului de infecție cu produse de reacție în lanț a polimerazei. De asemenea, din cauza scăderii numărului de manipulări cu agentul, reduce timpul studiului, se simplifică procesul, reduce riscul de erori. PCR, de asemenea, vă permite să specificați numărul inițial de copii ale ADN-ului agentului patogen într-un studiu clinic pentru a ajuta la identificarea perioadelor de exacerbări și să ia măsuri în timp util pentru a vindeca pacientul.

Până în prezent, există multe metode de fixare a amplificării în timp real. Cele mai frecvent utilizate diferite tehnici care aplica amplicon corelate cu sonde fluorogenice, dintre care intensitatea radiației variază în funcție de acumularea de amplicon și înregistrate în timp real cu ajutorul unui dispozitiv special numit termocicluri cu un modul optic. Acest lucru oferă un nivel ridicat de sensibilitate a analizei. În acest caz, produsul PCR poate fi detectat împreună cu o cantitate imensă de subproduse, în timp ce atunci când se utilizează electroforeza, adesea nu se observă.

Prin PCR, probele pozitive, de control și negative sunt utilizate în timp real. Astfel, probele pozitive și negative în timpul studiului sunt analizate ca probe separate, proba de control este apoi adăugată la fiecare astfel de probă și trece prin toate etapele analizei.

Până în prezent, există un număr mare de instrumente pentru reacția în lanț a polimerazei. Acestea includ Bio-Rad, Applied Biosystems, Cepheid sau Roche. Fiecare dintre ele are merite și dezavantaje

Trebuie remarcat faptul că PCR - metoda de diagnostic utilizate pe scară largă în-științifice, de cercetare și centre de diagnostic din intreaga lume, deoarece oferă posibilitatea de a efectua o interpretare imediată a rezultatelor.