Fluorescență microscopie: principiile metodei

Absorbția și reradiarea ulterioară a luminii de către mediile anorganice și organice sunt rezultatul fosforescenței sau fluorescenței. Diferența dintre fenomene constă în durata intervalului dintre absorbția luminii și emisia fluxului. Cu fluorescență, aceste procese apar aproape simultan și cu fosforescență - cu o anumită întârziere.

Istoricul istoric

În 1852, omul de știință britanic Stokes a descris pentru prima dată fluorescența. El a introdus un nou termen ca urmare a experimentelor cu fluorină, care a emis lumina roșie sub influența ultravioletului. Stokes a remarcat un fenomen interesant. El a descoperit că lungimea de undă cu radiație fluorescentă este întotdeauna mai mare decât cea a fluxului luminii de excitație.

Pentru a confirma ipoteza din secolul al XIX-lea, s-au desfășurat numeroase experimente. Ei au arătat că o varietate de probe fluoresc sub acțiunea ultravioletului. Printre materiale, printre altele, erau cristalele, rășinile, mineralele, clorofila, materiile prime medicinale, compușii anorganici, vitaminele și uleiurile. Aplicarea directă a coloranților pentru efectuarea analizelor biologice a început abia în 1930.

Fluorescentă microscopie: descriere

Unele dintre materialele folosite în studiile din prima jumătate a secolului XX au avut o specificitate ridicată. Datorită unor indicatori care nu au putut fi realizați prin metode de contrast, metoda de microscopie fluorescentă a devenit un instrument important atât în ​​cercetarea biomedicală, cât și în cea biologică. Rezultatele obținute nu aveau o importanță mică pentru știința materialelor.

Care sunt avantajele microscopiei fluorescente?? Cu ajutorul unor noi materiale a devenit posibilă izolarea celulelor foarte specifice și a componentelor submicroscopice. Un microscop fluorescent poate detecta molecule individuale. O varietate de coloranți permit identificarea mai multor elemente în același timp. În ciuda rezoluției spațiale limitate a echipamentului prin limita de difracție, care la rândul său depinde de proprietățile specifice ale probei, detectarea moleculelor sub acest nivel este, de asemenea, foarte posibilă. Diverse eșantioane după iradiere prezintă autofluorescență. Acest fenomen este utilizat pe scară largă în industria petrolieră, botanică, industria semiconductorilor.

caracteristici

Studiul țesuturilor de origine animală sau al microorganismelor patogene este adesea complicat fie de fluorescența auto nespecifică prea slabă, fie foarte puternică. Cu toate acestea, semnificația în studii este introducerea în material a componentelor excitate la o anumită lungime de undă și care emit un flux de lumină cu intensitatea necesară. Fluorocromii acționează ca coloranți capabili să se atașeze structurilor (invizibile sau vizibile). În același timp, ele sunt foarte selective în ceea ce privește obiectivele și randamentul cuantic.

Fluorescentă microscopie au devenit utilizate pe scară largă odată cu apariția coloranților naturali și sintetici. Au avut profiluri precise de intensitate a emisiei și excitației și au vizat ținte biologice specifice.

Identificarea moleculelor individuale

Adesea, în condiții ideale, se poate înregistra strălucirea unui element individual. Pentru a face acest lucru, printre altele, este necesar să se asigure un zgomot suficient de scăzut al detectorului și un fundal optic. Moleculele fluoresceinei înainte de distrugere din cauza fotopolimerizării pot emite până la 300 mii de fotoni. La 20% din colectarea și eficiența procesului, acestea pot fi înregistrate în valoare de aproximativ 60 mii.

Fluorescentă microscopie, bazat pe fotodiodele de avalanșă sau pe multiplicarea electronilor, a permis cercetătorilor să observe comportamentul moleculelor individuale pentru câteva secunde și, în unele cazuri, minute.

complexitate

Problema cheie este suprimarea zgomotului din fundalul optic. Datorită faptului că multe dintre materialele utilizate în proiectarea filtrelor și lentilelor prezintă o anumită autofluorescență, eforturile oamenilor de știință din etapele inițiale au fost axate pe producerea de componente cu fluorescență scăzută. Cu toate acestea, experimentele ulterioare au condus la noi concluzii. În special, sa constatat că fluorescentă microscopie, bazată pe o reflexie internă completă, permite obținerea unui fundal scăzut și a unui flux de lumină incitant de intensitate ridicată.

mecanism

Principiile microscopiei fluorescente, bazată pe reflexia internă totală, constă în utilizarea unui val de dezintegrare rapidă sau non-propagând. Se ridică la granița dintre mass-media și diferite indicii de refracție. În acest caz, fasciculul de lumină trece prin prisma. Are un indice de refracție ridicat.

Prisma este atașată la o soluție apoasă sau la un pahar cu un parametru scăzut. Dacă fluxul de lumină este îndreptat spre el la un unghi care este mai mare decât cel critic, fasciculul este reflectat complet de la interfață. Acest fenomen, la rândul său, provoacă un val de propagare. Cu alte cuvinte, este generat un câmp electromagnetic care pătrunde în mediu cu un indice de refracție mai mic pentru o distanță mai mică de 200 nanometri.

Într-un val care nu propagă intensitatea luminii vor fi destul de suficiente pentru a excita fluoroforii. Cu toate acestea, datorită adâncimii sale extrem de scăzute, volumul său va fi foarte mic. Ca urmare, apare un fundal de nivel scăzut.

modificare

Microscopia fluorescentă, bazată pe reflexia internă totală, poate fi realizată cu ajutorul epi-iluminării. Acest lucru necesită lentile cu o deschidere numerică mărită (cel puțin 1,4, dar este de dorit să ajungă la 1,45-1,6), precum și un câmp parțial iluminat al dispozitivului. Acesta din urmă este realizat prin utilizarea unui spot de dimensiuni mici. Pentru o uniformitate mai mare, se utilizează un inel subțire, prin care o parte a fluxului este blocată. Pentru a obține un unghi critic, după care are loc o reflexie totală, este nevoie de un nivel ridicat de refracție a mediului de imersie în lentile și de sticla de acoperire a microscopului.